01 Antecedentes y desafíos de la I+D
1.1 Antecedentes del desarrollo de fármacos de MK-0616
El decanoato de enlicitida (también conocido como MK-0616) es el primer inhibidor del péptido PCSK9 macrocíclico oral diseñado completamente de novo destinado a reducir el colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad (LDL-C) y tratar la enfermedad cardiovascular aterosclerótica.
Como se muestra en la figura anterior, además del MK-0616, los ejemplos clásicos en este campo también incluyen el antibiótico vancomicina (2), el agente quimioterapéutico paclitaxel (3) y el fármaco anticancerígeno eribulina (4). Las complejas estructuras de los compuestos 2 y 3 significan que su síntesis real todavía se basa en métodos semisintéticos basados en productos naturales; por el contrario, el equipo de Eisai logró la síntesis total del compuesto 4 a través de más de 60 pasos, lo que marcó un hito en la síntesis de compuestos policétidos.
En cuanto a MK-0616, su estructura química es muy singular: es la primera molécula diseñada íntegramente desde cero (en lugar de derivada de fuentes naturales); Además, como inhibidor oral diario de la PCSK9 destinado al tratamiento de enfermedades cardiovasculares más que a aplicaciones oncológicas o antiinfecciosas, su demanda global superará con creces la de los medicamentos innovadores convencionales, lo que requerirá una producción a una escala que va desde cientos de kilogramos hasta varias toneladas.
1.2 Desafíos y estrategias sintéticos
La complejidad molecular de MK-0616 impone requisitos estrictos al desarrollo de procesos.
Características estructurales: aunque MK-0616 se origina a partir de un péptido macrocíclico identificado mediante la detección con tecnología de visualización de ARNm, contiene 6 aminoácidos no canónicos (un total de 8 unidades de aminoácidos), un macrociclo de 37 miembros, una cadena lateral de sal de amonio (10) y un fragmento no peptídico (13), lo que hace que las técnicas convencionales de síntesis de péptidos en fase sólida sean completamente ineficaces, como se ilustra a continuación.
Los principales desafíos a abordar
1、La estabilidad de los intermedios polares (particularmente para fragmentos de sal de amonio, donde el contraión debe controlarse durante todo el proceso)；
2、La selectividad del cierre de anillos grandes (requiere optimización de la secuencia de ensamblaje entre 10 bloques)；
3、Desafíos de ampliación (evitar la purificación cromatográfica; garantizar un rendimiento a escala de miligramos a kilogramos)；
Por lo tanto, La decisión clave propuesta por los investigadores es la siguiente.：
1、divide y vencerás：Priorizar la construcción del "fragmento del Norte" (un anillo de 17 miembros compuesto de aminoácidos no canónicos en las posiciones 5, 6 y 7) y simplificar la estrategia de escisión macrocíclica mediante análisis retrosintético (por ejemplo, seleccionando el enlace amida entre las posiciones 5 y 8).
2、Introducción a la cadena lateral del terminal：El fragmento de sal de amonio polar (10) se reservará para el paso de instalación final para evitar desafíos asociados con la purificación intermedia.
3、La aplicación flexible del ácido–reacciones de neutralización de bases (RCM)：Se forma una cadena unida a n-hexano en las posiciones 7–13; esta reacción exhibe una excelente ortogonalidad y puede llevarse a cabo en múltiples etapas.
A través de esta serie de estrategias, los investigadores finalmente han establecido una ruta sintética escalable, allanando el camino para la evaluación clínica.02
02 Estrategia sintética y optimización
A través de estudios analíticos, los investigadores realizaron una optimización de múltiples pasos y generaciones del fragmento macrocíclico clave (fragmento Norte) y optimizaron el ensamblaje del fragmento Sur con el producto final.
2.1 Optimización multigeneracional del segmento Norte:
Primera generación– 37 iteraciones
La síntesis de aminoácidos no canónicos (por ejemplo, 3-hidroxiprolina) muestra una baja eficiencia, ya que depende de reacciones de ciclación ineficientes.—como la condensación de Dieckmann—así como resolución quiral; además, este proceso requiere múltiples rondas de manipulación del grupo protector y varias purificaciones cromatográficas, como se ilustra en la figura siguiente.
Todos estos factores limitan la síntesis a gran escala de fragmentos objetivo.
Sistema síncrono de segunda generación
Se logró un gran avance mediante la biocatálisis: la introducción de la reducción de cetonas (KRED) permitió la reducción altamente eficiente y estereoselectiva deβ-hidroxiésteres; Además, se utilizó la enzima TrpB diseñada para sintetizar triptófano fluorado, eliminando así la necesidad de resolución quiral. Como resultado, se redujo el número de pasos sintéticos y se minimizó el uso de grupos protectores, como se ilustra en la siguiente figura.
Esta ruta sintética para la optimización del fragmento Northern también se ha aplicado en el desarrollo clínico; sin embargo, las oportunidades que surgen de la estrategia estructural han creado la necesidad de una mayor optimización de la vía de síntesis de fragmentos.
Primero, los hallazgos clave con respecto a los tres intermedios de cristalización de etapa tardía proporcionan un punto crítico para el control de la pureza; por lo tanto, es fundamental modificar la ruta sintética para interceptar estos tres intermedios.
En segundo lugar, se recomienda llevar a cabo la reacción de ciclotrimerización de olefinas lo más tarde posible durante el proceso de síntesis. Este enfoque se basa en la consideración de que los catalizadores de rutenio pueden aumentar el coste global de producción de benzotiuramina; Por tanto, realizar esta reacción en la etapa final de la ruta sintética puede reducir significativamente los costos.
Por tanto, esto ha facilitado la optimización del enfoque de tercera generación.
Sistema de pasos comunes de tercera generación
Mediante hidroxilación enzimática, la L-prolina se oxida directamente a 3-hidroxiprolina con una estereoselectividad superior a 99:1; Se identificaron intermedios clave, como la cristalinidad de la sal de bencenosulfonato, que permitió evitar la purificación cromatográfica; Se empleó ensamblaje modular, junto con ajustes a la secuencia de acoplamiento de aminoácidos y simplificación de la estrategia del grupo protector, como se ilustra en la figura siguiente.
El fragmento sintético MK-0616 Northern de tercera generación se diferencia de los fragmentos sintetizados en las dos generaciones anteriores. Esta selección fue impulsada por la identificación del pentanoato cristalino 91, que carece del residuo de aminoácido treonina (que se incorporará más adelante durante la síntesis). Esta sal se puede aislar con alto rendimiento y pureza y proporciona un intermedio altamente estable que se puede almacenar como intermedio clave durante todo el proceso de síntesis.
Gracias a la optimización en la tercera generación, la separación del nuevo fragmento Northern (91) ahora requiere solo 14 pasos.—sólo un tercio del número de pasos necesarios para la síntesis de primera generación. Además, es importante señalar que en el protocolo de tercera generación, la secuencia lineal más larga se ha reducido a más de la mitad, pasando de 20 pasos a 9 pasos.
2.2 Optimización del fragmento Sur
Primera generación, compuesta por 15 pasos.
A partir de materias primas adquiridas en grandes cantidades a proveedores comerciales, el proceso de 9 pasos representa la secuencia lineal más larga, como se muestra en la siguiente figura.
Sistema síncrono de segunda generación
En la síntesis de segunda generación, lo que se mejoró no fue el número de pasos, sino la eficiencia general y el control de pureza, como se ilustra en el siguiente esquema. Después de miles de pruebas, se identificó un fragmento de transferencia Southern llamado sal de leelamina (99).
Se ha demostrado previamente que el uso de estos dos compuestos sirve como disolventes no quirales para ácidos carboxílicos; en consecuencia, la sal cristalina (99) se puede obtener sorprendentemente como una sustancia altamente pura, evitando así el extenso trabajo preparativo de HPLC requerido en la generación anterior de síntesis.
2.3 Montaje del producto final
Tanto el fragmento Northern de primera generación como el segundo intermedio del fragmento Southern pueden protegerse fácilmente para producir el precursor lineal 61, como se muestra en la figura siguiente; sin embargo, el rendimiento del producto de metátesis de cicloolefina es muy bajo.
Independientemente, los investigadores emplearon con éxito otra secuencia, lo que permitió la primera síntesis escalable de MK-0616, como se ilustra en el siguiente esquema.
Las sales de enaldehído de primera generación se sintetizaron mediante un proceso de 63 pasos que comienza con la instalación de cadenas laterales en el núcleo molecular mediante una amidación de alto rendimiento seguida de una purificación con SFC; entre estos pasos, el paso 28 representa la secuencia lineal más larga.
La combinación de productos finales de segunda generación se muestra en la siguiente figura.
Al optimizar las rutas para los fragmentos del Norte y del Sur que se dirigen al producto objetivo, ambos enfoques pueden utilizar intermedios cristalinos de fragmentos planos para avanzar a la etapa final de síntesis.
Esta reacción de acoplamiento es suficientemente limpia para pasar directamente al siguiente paso usando una reacción cruda.
En general, la ruta sintética de segunda generación para MK-0616 requiere 43 pasos, de los cuales 21 constituyen la secuencia lineal más larga. Esta secuencia reduce en un tercio tanto el número total de pasos como la longitud de la secuencia lineal más larga en comparación con el proceso de primera generación.
03 Innovación tecnológica clave
Un análisis de todo el proceso de optimización revela varias innovaciones en tecnologías clave, tales como:
1、Tecnología de biocatálisis:Resolución cinética dinámica KRED; Síntesis de análogos de triptófano mediada por la enzima TrpB; introducción directa de grupos hidroxilo mediante prolina hidroxilasa; etc.
2. Purificación impulsada por cristalización: Múltiples pasos intermedios—tales como el metilsulfonato de fragmentos de transferencia Northern o la sal de leelamina de fragmentos de transferencia Southern—se emplean para lograr la purificación por cristalización, eliminando así la necesidad de columnas de cromatografía.
3. Estrategia de grupo protector ortogonal: conmutación flexible entre grupos protectores como Boc y Nosyl para garantizar la selectividad de reacciones de varios pasos.
4. Consideraciones sobre la química verde: reducir el uso de catalizadores de metales pesados (por ejemplo, catalizadores de rutenio) y trasladar la reacción RCM a una etapa posterior para reducir los costos de producción.
04 Resumen y perspectivas
Este artículo demuestra una integración flexible de la biocatálisis y la síntesis química, al tiempo que enfatiza el papel fundamental de los procesos de cristalización y adopta un enfoque de diseño modular, mostrando así una metodología sistemática que abarca desde la exploración de laboratorio hasta la producción a escala industrial. Este trabajo representa un caso ejemplar en el campo de la síntesis molecular compleja: el número total de pasos se redujo de 63 en el protocolo de primera generación a 43 en el protocolo de segunda generación, con rendimientos aumentados casi 1.000 veces y permitiendo la viabilidad de la producción a escala de toneladas. A lo largo de todo el proceso, se pone énfasis estratégico en el paso de cristalización, evitando así la purificación cromatográfica, característica que lo hace muy adecuado para la producción a escala de toneladas. Además, este estudio proporciona una plantilla técnica para los enfoques sintéticos de otros péptidos macrocíclicos complejos.
