Las cascadas biocatalíticas permiten la fabricación del péptido macrocíclico Enlicitida

El inhibidor oral de PCSK9 en investigación de MSD, el decanoato de enlicitida (MK-0616), es el primer inhibidor del péptido macrocíclico oral de PCSK9 que demuestra una reducción sustancial del LDL-C en humanos. La enlicitida se desarrolló a partir de una pantalla de visualización de ARNm de péptidos monocíclicos y posteriormente se estabilizó mediante enlaces cruzados no peptídicos para generar una estructura que comprende tres macrociclos fusionados. Este octapéptido complejo contiene seis aminoácidos no naturales y dos proteinogénicos conectados por 12 enlaces amida y un conector de cadena central de seis carbonos. La síntesis química tradicional requiere 43 pasos, manipulaciones de grupos protectores (casi la mitad de los pasos sintéticos), purificaciones cromatográficas y un paso de metátesis de cierre de anillo catalizado por rutenio altamente diluido, lo que limita la escalabilidad y la sostenibilidad.

Desarrollo de fabricación quimioenzimática

Los científicos de MSD desarrollaron un proceso quimioenzimático conciso y convergente para fabricar decanoato de enlicitida (1) posible mediante el acoplamiento directo de monómeros mediante ligasas de aminoácidos, combinado con ligadura de fragmentos de péptidos biocatalíticos y macrociclizaciones utilizando esterasas e imina reductasas.

Logros clave

Conjunto de cascada de tres enzimas utilizando ligasas de agarre de ATP

- La cascada de tres enzimas (dos ligasas de captura de ATP diseñadas + reciclaje de ATP) ensambla un tetrapéptido a partir de aminoácidos desprotegidos. Las ligasas de agarre de ATP (específicamente ligasas de aminoácidos dependientes de ATP, AAL) son enzimas que catalizan la formación de enlaces amida entre aminoácidos o péptidos desprotegidos utilizando ATP como fuente de energía. Su mecanismo se produce a través de un intermedio de anhídrido mixto, que permite el acoplamiento directo sin necesidad de grupos protectores en la amina nucleófila o los donantes de acilo activados. En este estudio, los investigadores utilizaron una ligasa de agarre de ATP de Bifidobacterium adolescente (BaAAL) y variantes diseñadas (Trp-BaAALEng y Phe-BaAALEng) para extender selectivamente un dipéptido con dos aminoácidos no naturales (análogos de triptófano y fenilalanina) en una cascada de un solo recipiente. Estas ligasas tienen una bolsa electrófila estrecha y enterrada que acepta aminoácidos individuales como electrófilos (sustratos C-terminales), pero puede acomodar péptidos más largos como N-nucleófilos. Esta selectividad los hace ideales para el ensamblaje secuencial de péptidos sin grupos protectores desde el extremo C al extremo N. El ATP consumido se recicla mediante una polifosfato quinasa (FbPPKWT) con hexametafosfato económico como donante de fosfato.

Macrolactamización regioselectiva de esterasa diseñada (RsEstEng)

- La esterasa modificada (RsEstEng) cataliza la macrolactamización regioselectiva para formar el fragmento Northern (rendimiento del 73 %, escala de 52 kg). RsEstEng se deriva de una carboxilesterasa de tipo salvaje (RsEst) identificada a partir de Roseibacillus sp. Su función nativa es la hidrólisis de enlaces éster. Mediante evolución dirigida, los investigadores lo convirtieron en un catalizador para la macrolactamización regioselectiva (la formación de un enlace amida macrocíclico) en la síntesis del fragmento Northern (4) de enlicitida. Acepta el éster terc-butílico estable y voluminoso del tetrapéptido lineal (9) como donante de acilo para producir el péptido macrocíclico (4) para formar un enlace amida intramolecular. Logró una ciclación selectiva sin oligómeros detectables y solo un 0,8 % de subproducto de hidrólisis de éster, incluso en las condiciones de alta fuerza iónica de la cascada enzimática anterior.

Ligadura intermolecular de tioesterasa diseñada (BlTEEng)

- La tioesterasa diseñada (BlTEEng) realiza la ligadura intermolecular de fragmentos norte (4) y este (3) sin epimerización. BlTEEng es una versión modificada de un dominio de tioesterasa (TE) originalmente escindido de la péptido sintetasa no ribosomal (NRPS) de Brevibacillus laterosporus (BlTE). Las tioesterasas de tipo salvaje en los sistemas NRPS normalmente catalizan la macrociclación o la liberación de péptidos lineales de una proteína transportadora a través de un enlace tioéster. Las variantes diseñadas de BlTE mostraron cierta actividad pero favorecieron los subproductos diméricos. La ingeniería enzimática cambió la enzima para catalizar la ligadura intermolecular utilizando oxoésteres de isopropilo más estables en lugar de los tioésteres naturales, hidrolíticamente lábiles.

Macrociclización de aminación reductiva en cascada de cuatro enzimas

- La cascada de cuatro enzimas (PsIREDEng, KsKREDEng y las enzimas de reciclaje cofactor StLDHWT, TvADHWT) logra una macrociclización de aminación reductora para formar una diamina bicíclica (rendimiento del 69 %, escala de 46 kg). KsKREDEng es una cetorreductasa diseñada a partir de Kyrpidia sp. Cataliza la oxidación de un compuesto de alcohol bencílico (10) a un aldehído transitorio (11) dependiente de NAD+. PsIRED es una imino reductasa de Pseudogymnoascus sp. Depende de NADPH. PsIREDEng cataliza la aminación reductora del aldehído (11) y la amina existente para formar la imina cíclica (12), seguida de la reducción al macrociclo de amina secundaria (13). StLDHWT regenera NAD+ para el paso oxidativo al reducir el piruvato a lactato, mientras que TvADHWT regenera NADPH para el paso reductor al oxidar el isopropanol a acetona.

Macrociclación final mediante tioesterasa PBP diseñada

- El acoplamiento químico con el fragmento Western (2), seguido de la proteína tioesterasa de unión a penicilina modificada (SsPBP-TEEng), cierra el macrociclo final en alta concentración (70 g/L), superando la limitación de dilución típica (5 g/L en la síntesis tradicional). El proceso general incluye tres pasos en cascada, 7 enzimas diseñadas + 3 auxiliares, 39 % de rendimiento general, demostración a escala de varios kilogramos, >99 % de pureza, sin cromatografía y sin grupos protectores. Este trabajo proporciona un modelo sostenible y escalable para fabricar péptidos macrocíclicos complejos, reduciendo drásticamente el recuento de pasos y el desperdicio al tiempo que mejora la eficiencia y el acceso de los pacientes.